何曉松1　錢志英1　何流2　周曉明1　戴美紅1　張成陽3
（1江蘇省腫瘤醫(yī)院  江蘇省腫瘤防治研究所  江蘇 南京 210009；
2南京市江寧醫(yī)院  江蘇 南京 211100；3鹽城市腫瘤醫(yī)院  江蘇 鹽城 224003）

【摘要】 目的  建立實(shí)時熒光定量RT-PCR方法檢測survivin mRNA的表達(dá)。 方法  用Trizol方法提取食管癌組織總RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ，建立實(shí)時熒光定量RT-PCR 方法，檢測人食管癌 survivin mRNA的表達(dá)。結(jié)果  survivin mRNA在癌組織中高度表達(dá)，與正常食管粘膜有顯著性差異。 結(jié)論 所建立的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法用于檢測檢測人食管癌survivin mRNA的表達(dá)，是一種快速有效﹑靈敏度高﹑特異性好的定量檢測方法。
【關(guān)鍵詞】 食管癌  實(shí)時熒光定量RT-PCR   survivin mRNA
Detection of surviving mRNA in esophageal cancer by real-time fluorescence quantitative RT-PCR；HE Xiao-song,QIAN Zhi-ying,HE Liu,et al.Department of Oncology，Cancer Institute and Hospital of Jiangsu，Nanjing，Jiangsu，210009 China
【Abstract】  Objective  To establish a real-time fluorescence quantitative RT-PCR.  MethodsTotal RNA was extracted with Trizol from the esophageal carcinoma tissues and mRNA was transcribed reversely into cDNA. The real-time quantitative RT-PCR was used to detect the expression of survivin mRNA. Results  The expression of survivin mRNA in the esophageal carcinoma tissues was significantly higher than that in the normal esophageal tissue. Conclusion  Real-time fluorescence quantitative RT-PCR used to detect the expression of survivin mRNA may be a reliable means for early diagnosis of esophageal carcinoma.
【Key Words】 Esophageal carcinoma; Real-time fluorescence quantitative RT-PCR; Survivin mRNA
 
　　Survivin mRNA 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重作用［1］。Survivin 選擇性地表達(dá)于胚胎組織和人類大多數(shù)腫瘤組織，而在正常人終末分化組織中不表達(dá)［2，3］。對survivin 的分子生物學(xué)﹑組織分布特征﹑凋亡抑制機(jī)制及其于腫瘤的發(fā)生發(fā)展﹑細(xì)胞周期關(guān)系的研究已取得了一定進(jìn)展。本研究擬建立實(shí)時熒光定量RT-PCR方法對食管癌組織測定survivin mRNA的表達(dá)水平。

1 材料與方法
　　1.1 材料 胃鏡下取食管標(biāo)本52例，其中男性39例，女性13例。經(jīng)病理組織學(xué)診斷：正常黏膜9例，侵潤性癌43例。

　　1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑盒Teizol Reagant 為Invitrign公司產(chǎn)品，引物﹑熒光探針合成和PCR反應(yīng)試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供，ABI Prisnxr 7000熒光定量PCR儀為美國PE公司產(chǎn)品。引物和探針設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［4］。上游引物序列為：5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′,下游引物序列為：5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′,探針序列為：5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3′。

　　1.3 方法 
　　　　1.3.1 RNA提取  通過胃鏡下取食道黏膜組織，應(yīng)用Teizol Reagant試劑盒，按說明書要求提取RNA，同時送病理做出組織學(xué)診斷。所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)測A280﹑A260定量并檢測其純度。A280／A260≥1.8為合格。所提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的28S﹑18S兩條區(qū)帶，證明其完整性。－70℃保存待用。
　　　　1.3.2 cDNA合成  20μl中含：總RNA 1μg，10×緩沖液2μl,dNTPs（10mmol/L）2μl,100ng隨機(jī)引物，M-MLV(10U/μl)2μl,加DEPC水至20μl。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 55 min, 93℃ 3 min。
　　　　1.3.3 熒光定量PCR  50μl反應(yīng)體系中含：1×定量緩沖液，dNTPs 200μl mol/L,5U ampliTaq Gold,survivin上下游引物各600 nmol/L,熒光探針200 nmol/L,100ng cDNA。反應(yīng)條件為：50℃ 10s,95℃ 10 min,然后95℃ 15s,60℃ 1min,共42個循環(huán)。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　用SPSS 11.0 For Windows 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素分差分析，P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果
　　2.1 Survivin陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制定及Ct值的測定Survivin 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建由中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司完成，所得到的survivin標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，稀釋成不同的梯度濃度作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。以1×10～1×104不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。從圖1可見，不同起始濃度模板（分別為101﹑102﹑103﹑104﹑105）進(jìn)入PCR指數(shù)增長期的起始點(diǎn)即循環(huán)閾值（Cyle threshold,Ct）不同，拷貝數(shù)越大Ct值越小。同時也可見不同濃度的模板進(jìn)入PCR平臺期后，PCR產(chǎn)物相差也比較大且不成比例。圖2顯示不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與該標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始濃度越高，Ct值就越小。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相關(guān)系數(shù)為1，線性關(guān)系極好。根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始mRNA水平。
　　　　　　　
　　2.2 Survivin mRNA 在食管癌及正常食管粘膜中的表達(dá)  實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測survivin mRNA結(jié)果表明，43例食管癌標(biāo)本的survivin mRAN表達(dá)為4.01±0.54(log copies/mg總RNA),明顯高于食管正常粘膜的1.23±0.26。二者比較，P＜0.05，有顯著性差異。

3 討論
　　Survivin在細(xì)胞中的生理功能非常主要，涉及到細(xì)胞周期的調(diào)控﹑細(xì)胞凋亡和腫瘤中血管的生成等。研究表明survivin是乞今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，最新的研究表明survivin抗細(xì)胞凋亡存在兩種途徑，一種是經(jīng)典的caspases徑途，另一種是通過促進(jìn)細(xì)胞分裂而抑制細(xì)胞凋亡［5］。與IAP家族不同的是survivin不僅抑制細(xì)胞凋亡，還參與對細(xì)胞分裂的調(diào)控。Survivin的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性，在細(xì)胞周期的G2/M期選擇性地表達(dá)。在有絲分裂的開始，survivin與紡錘體的微管蛋白特異性結(jié)合，維護(hù)有絲分裂的正常進(jìn)行。干擾survivin和微管蛋白的反應(yīng)，可導(dǎo)致survivin抗凋亡活性的喪失［6］。血管形成確切地說取決于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存凋亡平衡的結(jié)果。已有研究表明survivin參與了血管形成過程，在腫瘤血管增生過程中，血管內(nèi)
　　皮生長因子（VEGF）與survivin存在正協(xié)同作用。VEGF的抗凋亡活性由內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的survivin介導(dǎo)，而VEGA的存在是survivin作用所必需的條件［7］。研究證明,survivin作為一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，在人類大多數(shù)惡性腫瘤中表達(dá)，具有強(qiáng)烈的凋亡抑制功能和促細(xì)胞增殖活性，并與腫瘤的血管生成和預(yù)后有密切的關(guān)系。
　　實(shí)時熒光定量RT-PCR不僅具有定性PCR的高靈敏度，而且由于熒光探針的應(yīng)用，通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接檢測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號的變化而獲得定量結(jié)果。該方法采用完全閉管檢測，不需要PCR后處理，避免了交叉污染。具有良好的特異性和較高的靈敏度。該系統(tǒng)對PCR的每一循環(huán)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，可準(zhǔn)確地測定起始模板量的大小。該系統(tǒng)的自動化程度高，每次可對96個樣品進(jìn)行分析。
　　Survivin的高度表達(dá)是大多數(shù)腫瘤的一個標(biāo)志，Kato等[8]的研究結(jié)果表明survivin在食管癌中的表達(dá)明顯高于正常組織。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，但我們采取實(shí)時熒光定量RT-PCR方法，可更為精確的反映survivin在腫瘤組織中的高度表達(dá)。我們期望對survivin在食管癌發(fā)生中所起的作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究，能對食管癌的早期診斷﹑預(yù)后判斷有所幫助。

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